Genetica Molecolare Applicata 2017/2018

CORSO DI LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE

A.A. 2017-2018

(7cfu frontali + 1 cfu di laboratorio) Prof. Patrizia Malaspina

MAPPATURA GENETICA DEL GENOMA

1) Tipi di eredità mendeliana.

Calcolo delle frequenze alleliche per loci polimorfici autosomici e associati al cromosoma X, in condizione di dominanza o codominanza. Equilibrio di Hardy-Weinberg. Valutazione dell’equilibrio nelle popolazioni con il test del chi-quadrato.

2) Definizione di marcatore genetico ed analisi della segregazione alla meiosi; analisi dell’associazione tra loci per la costruzione di mappe genetiche; identificazione delle meiosi informative; clonaggio posizionale per geni responsabili di malattie; uso del lod score per la valutazione dell’associazione nell’uomo (cenni).

3) Tipi di marcatori del DNA (RFLP, minisatelliti, microsatelliti, SNP), loro caratteristiche e relativi metodi per l’identificazione.

4) Tecniche per lo studio degli acidi nucleici

Ibridazione molecolare: principi e metodi; ibridazione di Southern blot, Northern blot, filtri con colonie batteriche.

Marcatura di acidi nucleici e metodi di rilevazione: marcatura isotopica e non isotopica (con fluorofori). Marcatura interna e terminale. Ibridazione fluorescente in situ di cromosomi (FISH).

La reazione a catena della polimerasi (PCR): principi ed applicazioni.

PCR quantitativa (RealTime PCR).

Sequenziamento del DNA con il metodo di Sanger; sequenziamento automatizzato.

MAPPATURA FISICA DEL GENOMA

1) Costruzioni di librerie genomiche e loro rappresentatività; librerie genomiche totali e librerie cromosoma-specifiche.

2) Caratteristiche principali dei vettori di clonaggio in procarioti (pBR322; pUC, M13, batteriofago lambda di sostituzione, cosmidi, BAC) ed eucarioti (cromosomi artificiali di lievito).

3) Metodi di identificazione dei cloni ricombinanti e loro assemblaggio in contigui (chromosome walking, fingerprinting del DNA ripetitivo, presenza di siti etichettati da una sequenza (STS).

4) Costruzione di librerie di cDNA.

POST-GENOMICA

1) Metodi per l’identificazione di geni espressi: ricerca di ORF, sequenze promotore (vettori con geni reporter, sequenze geniche caratteristiche, utilizzo di banche dati); studio dell’espressione genica (librerie di cDNA, microarray);

2) Produzione di proteine da geni clonati in procarioti: vettore di espressione pGEM, vettori con promotori inducibili; cassette e fusioni di geni; metodi di purificazione di proteine (cromatografia di affinità);

3) Produzione di proteine da geni clonati in eucarioti: vettori di espressione di lievito (YEp, YIp);

4) Studio delle interazioni proteina-proteina (phage display, sistema del doppio ibrido in lievito);

5) Produzione di proteine da geni clonati in cellule di mammifero: trasferimento genico mediante trasduzione virale.

6) Esempi di produzione proteine ricombinanti in cellule procariotiche ed eucariotiche; esempi di produzione di proteine in animali vivi (bioreattori).

7) Produzione di animali transgenici. Microiniezione nel pronucleo, trasferimento nucleare, trasfezione di cellule embrionali staminali. Trasferimento genico diretto o tramite vettori virali (retrovirus, adenovirus, virus adeno-associati). Inserzione genica ectopica o mirata;

TERAPIA GENICA: Applicazioni a malattie con perdita o acquisto di funzione; Terapia genica somatica (ex vivo e in vivo); terapia genica germinale. Esempi di terapia genica nell’uomo.

Testi consigliati:

Griffiths A.J.F et al.: Genetica: principi di analisi formale. Ed. Zanichelli (capitoli selezionati).

Brown T.A.: Biotecnologie Molecolari: principi e tecniche. Seconda edizione. Ed. Zanichelli.