Metodologie Biochimiche 2010/2011

Programma Metodologie Biochimiche corso LT BCM  e BU     

Metodi di visualizzazione delle cellule:

Generalita’ sull’ uso della microscopia ottica,  a fluoresceza, video microscopia e elettromicroscopia e la loro applicazione allo studio di proteine native o ricombinanti.  Uso della immunofluorescenza (diretta e indiretta).

Metodi di rottura delle cellule:

Omogenizzazione, French Press, sonicazione, metodi enzimatici e con l’uso di abrasivi. Importanza e contenuti dei principali tamponi di estrazione.

Tecniche di centrifugazione:

Principi di base della sedimentazione, tipi di rotori (angolo fisso , alloggiamento versticale, bracci oscillanti, elutriatori). Tipi di centruifughe. Tecniche di sedimentazione (differenziale, in gradiente di densita’, per elutriazione). Materiali per gradienti. Ultracentrifughe: generalita’ di utilizzo.

Purificazione e caratterizzazione delle proteine:

Proprieta’ ioniche degli aminoacidi e delle proteine native e in soluzione.  Punto isoelettrico. Stabilita’ (termica e in presenza di pH variabile). Criteri di solubilita’ e loro utilizzo per la purificazione delle proteine (frazionamento con sali, solventi organici, PEG, precipitazione isoelettrica). Utilizzo della metodi di quantificazione delle proteine in soluzione: spettrofotometria ottica e all’ultravioletto per la determinazione della concentrazione di campioni proteici,

colorazione di Bradford, Lowry.

Tecniche elettroforetiche e di trasferimento su carta, immunoblotting analysis:

Principi generali dell’elettroforesi su matrici solide. Elettroforesi su Gel di agarosio e poliacrilammide (PAGE). Matrici per elettroforesi e loro utilizzo. Elettroforesi su  SDS-PAGE.  Tipi di tamponi utilizzati per l’analisi PAGE : continui e discontinui. Isoelettrofocusing (IEF) e gel bidimensionali: criteri generali.  Generalita’ sull’uso di gel bidimensionali e il loro utilizzo in proteomica e spettrometria di massa (MALDI-TOF).

Western blotting. Tipi di membrane utilizzate e criteri di utilizzo. Rivelazione delle proteine tramite colorazione su gel :Comassie brilliant Blue, Silver staining. Rivelazione delle proteine: tramite colorazione su membrana (Ponceau S) o  con anticorpi coniugati ad enzimi o fluorocromi (immunodetection)

Tecniche cromatografiche:

Principi generali di cromatografia (Risoluzione, efficienza, capacità), cromatogramma. Cromatografia su colonna (setaccio molecolare, a scambio ionico, affinita’, idrofobicita’, HPLC, FPLC): generalità d’utilizzo.

Libro di testo consigliato:

 Keith Wilson and John Walker: Biochimica e biologia molecolare:Principi e tecniche

. EDs. 2006 Raffaello Cortina Editore.  ISBN 88-6030-066-5