Metodologie Biochimiche 2009/2010

Programma Metodologie Biochimiche
corso BCM e BU 2009-2010
 
 
 
Metodi di visualizzazione delle cellule:
Generalita’ sull’ uso della microscopia ottica, a fluoresceza, video microscopia e elettromicroscopia e la loro applicazione allo studio di proteine native o ricombinanti. Uso della immunofluorescenza (diretta e indiretta).
 
Metodi di rottura delle cellule:
Omogenizzazione, French Press, sonicazione, metodi enzimatici e con l’uso di abrasivi. Importanza e contenuti dei principali tamponi di estrazione.
 
Tecniche di centrifugazione:
Principi di base della sedimentazione, tipi di rotori (angolo fisso , alloggiamento versticale, bracci oscillanti, elutriatori). Tipi di centruifughe. Tecniche di sedimentazione (differenziale, in gradiente di densita’). Materiali per gradienti. Ultracentrifughe: generalita’ di utilizzo.
 
Purificazione e caratterizzazione delle proteine:
Proprieta’ ioniche degli aminoacidi e delle proteine native e in soluzione. Punto isoelettrico. Stabilita’ (termica e in presenza di pH variabile). Criteri di solubilita’ e loro utilizzo per la purificazione delle proteine (frazionamento con sali, solventi organici, PEG, precipitazione isoelettrica). Utilizzo della metodi di quantificazione delle proteine in soluzione: spettrofotometria ottica e all’ultravioletto per la determinazione della concentrazione di campioni proteici,
colorazione di Bradford, Lowry.
 
Tecniche elettroforetiche e di trasferimento su carta, immunoblotting analysis:
Principi generali dell’elettroforesi su matrici solide. Elettroforesi su Gel di agarosio e poliacrilammide (PAGE). Matrici per elettroforesi e loro utilizzo. Elettroforesi su SDS-PAGE. Tipi di tamponi utilizzati per l’analisi PAGE : continui e discontinui. Isoelettrofocusing (IEF) e gel bidimensionali: criteri generali. Generalita’ sull’uso di gel bidimensionali e il loro utilizzo in proteomica e spettrometria di massa (MALDI-TOF).
Western blotting. Tipi di membrane utilizzate e criteri di utilizzo. Rivelazione delle proteine tramite colorazione su gel :Comassie brilliant Blue, Silver staining. Rivelazione delle proteine: tramite colorazione su membrana (Ponceau S) o con anticorpi coniugati ad enzimi o fluorocromi (immunodetection)
 
Tecniche cromatografiche:
Principi generali di cromatografia (Risoluzione, efficienza, capacità), cromatogramma. Cromatografia su colonna (setaccio molecolare, a scambio ionico, affinita’, idrofobicita’, HPLC, FPLC): generalità d’utilizzo.
 
Libro di testo consigliato:
 Keith Wilson and John Walker: Biochimica e biologia molecolare:Principi e tecniche
. EDs. 2006 Raffaello Cortina Editore. ISBN 88-6030-066-5