Principi e applicazioni della citometria a flusso. Vantaggi e limiti rispetto ad altre tecnologie.
Principi di base: interazione luce-particella, diffusione, diffrazione, fluorescenza.
Strumentazione: componenti ottica, fluidica, elettronica e software.
Sonde fluorescenti in citometria, aspetti generali, spettro di eccitazione e di emissione, FRET, fluorocromi tandem. Lo spillover e la compensazione.
Preparazione del campione, sospensione monocellulare, vitalità, fissazione, permeabilizzazione, conservazione.
Marcatura di molecole di superficie cellulare, intracellulari e intranucleari.
Analisi multiparametriche. Principi di analisi dei campioni, valutazione della vitalità delle cellule, la compensazione off line, i controlli di marcatura (blank, controlli isotipico e isoclonico, fluorescence minus one). Strategie di gating. Criteri per la valutazione della positività (marcatori positivi/negativi, low/high, continui); percentuali di cellule positive, intensità media e mediana di fluorescenza. Rappresentazione dei dati citometrici, istogrammi, dot plot, density plot, contour plot.
Analisi del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, apoptosi, attivazione cellulare (flusso di calcio, fosforilazione di proteine).
Analisi di proteine intracellulari e nucleari e di RNA. Misura di analiti in sopranatanti di coltura e fluidi biologici. Confronti con western blot, RT-PCR ed ELISA.
Fenotipizzazione dei leucociti; identificazione di sottopopolazioni di linfociti.
Studio dello sviluppo e della maturazione dei linfociti mediante citometria.
Valutazione della fagocitosi mediante citometria.
Esempi di applicazioni non biomediche.
Cenni di sorting cellulare mediante citometria.
Esercitazioni teorico-pratiche con analisi di campioni.
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