Genomica E Bioinformatica Dei Microrganismi 2019/2020

-Introduzione al corso: differenze di base tra la genetica degli organismi eucariotici e procariotici. Bioinformatica in microbiologia. Esempi di applicazioni: caratterizzazione di comunità microbiche, analisi di nuovi generi e specie, caratterizzazione di elementi genetici mobili, evoluzione di batteri e virus, applicazioni di bioinformatica in microbiologia clinica. Principi del sequenziamento del DNA usando il metodo Sanger.

-Il sito web di NCBI: Introduzione e breve storia, strumenti e database utili per la genetica microbica, strategie di ricerca di base ed avanzate tramite l'applicazione web. Il database GenBank e la sua classificazione nelle divisioni. Il database RefSeq. Gli accession numbers.

- Formati di file frequentemente  utilizzati in bioinformatica: fasta, fastq, sam/bam, vcf. Annotazione funzionale e strutturale del DNA e delle proteine: i formati di file GenBank/DDBJ/EMBL.

-Interrogazione dei database dell'International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC): interrogazioni tramite interfacce web e strumenti per l'accesso programmatico tramite riga di comando ed E-Utilities. Strumenti per l' invio di sequenze di DNA in GenBank. Invio di brevi sequenze di DNA utilizzando lo strumento BankIt. Lo strumento BLAST: principi dell'algoritmo, utilizzo del web BLAST e della versione standalone.

-Gestione di file: Conversione tra diversi formati ed estrazione di dati tramite scripting e strumenti web: conversione da fastq a fasta, conversione da GenBank/DDBJ/EMBL a fasta, estrazione di reads da file bam/sam, concatenazione di varianti genetiche presenti in file vcf per eseguire analisi filogenetiche. Strumenti Web per estrarre informazioni dai file di GenBank.

- Piattaforme di Next Generation Sequencing (NGS): informazioni di base sulle piattaforme NGS più comuni: Illumina, IonTorrent, Roche 454, PacBio e Minion. Vocabolario di base di NGS (throughput, coverage). Analisi delle strategie di sequenziamento alla base delle più comuni piattaforme NGS: vantaggi e svantaggi. Definizione di approcci sperimentali di un esperimento NGS.

-Valutazione della qualità dei risultati ottenuti da un esperimento NGS: analisi della quantità di sequenze ottenute, della loro qualità di chiamate di base e del tasso di sequenze duplicate mediante FastQC. Rimozione di sequenze di bassa qualità: esempi di approcci diversi utilizzati da DynamicTrim e Trimmomatic.

- Approcci analitici dei dati NGS: read mapping e assemblaggio de novo: principi dei due approcci (algoritmo bwa e grafico di de Bruijn). Esempi di software per l'analisi e l'interpretazione dei risultati: read mapping con bwa, utilizzo di bwa / samtools / bcftools per studiare le variazioni genetiche, strategie di reaad mapping per la definizione del profilo MLST di un isolato, costruzione di uno pseudo-genoma, assemblaggio de novo di un genoma batterico utilizzando SPAdes e ABySS. Parametri utili per confrontare diversi assemblaggi de novo (numero di contigs, N50, L50, NG50, copertura). Il software Quast. Punti critici degli approcci di read mapping e assemblaggio de novo: esempi di problemi derivanti da sequenze ripetute, utilizzo della qualità di mapping dell reads Strategie per la connessione di diversi contig: chiusura gap mediante amplificazione PCR, analisi dei frammenti di restrizione e sequenziamento di Sanger, generazione di scaffolds sfruttando reads lunghe, formulazione di ipotesi di connessione contig e loro validazione. Connessione di contigs sfruttando la biologia delle sequenze di inserzione o approcci basati su references.

-Annotazione di genomi batterici e virus batterici: strategie e utilizzo del servizio web RAST. Chiamate di Open Reading Frames (ORF).

-Strumenti web utili per bioinformatica di microrganismi: analisi del resistoma batterico con ResFinder, analisi dei repliconi plasmidici con PlasmidFinder, genotipizzazione batterica tramite MLST. Genotipizzazione del locus capsulare attraverso BIGsDB. Analisi dei fagi usando PHAST.

-Studi di comunità microbiche: il microbioma umano. Esempi di fattori che alterano il microbioma umano e di approcci per ripristinare il suo equilibrio. Approcci basati sul sequenziamento mirato (rDNA 16S): flusso di lavoro sperimentale generale e strategie per analizzare i risultati. Esempio di analisi di microbiomi tramite QIIME.