Citometria A Flusso 2019/2020

 Programma Citometria a Flusso A.A. 2019/2020 (Claudio Pioli)

Principi e applicazioni della citometria a flusso. Vantaggi e limiti rispetto ad altre tecnologie.

Principi di base: interazione luce-particella, diffusione, diffrazione, fluorescenza.

Strumentazione: componenti ottica, fluidica, elettronica e software.

Sonde fluorescenti in citometria, aspetti generali, spettro di eccitazione e di emissione, FRET, fluorocromi tandem. Lo spillover e la compensazione.

Preparazione del campione, sospensione monocellulare, vitalità, fissazione, permeabilizzazione, conservazione, congelamento/scongelamento.

Marcatura di molecole di superficie cellulare, intracellulari e intranucleari.

Analisi multiparametriche. Principi di analisi dei campioni, valutazione della vitalità delle cellule, la compensazione off line, i controlli di marcatura (isotipico, isoclonico, fluorescence minus one, FMO), strategie di gating. Criteri per la valutazione della positività (marcatori positivi/negativi, low/high, continui); percentuali di cellule positive, intensità media e mediana di fluorescenza; rappresentazione dei dati citometrici.

Analisi del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, apoptosi, attivazione cellulare (flusso di calcio, fosforilazione di proteine).

Analisi di proteine intracellulari e nucleari e di RNA. Misura di analiti in sopranatanti di coltura e fluidi biologici. Confronti con western blot, RT-PCR ed ELISA.

Fenotipizzazione dei leucociti; identificazione di sottopopolazioni di linfociti. 

Studio dello sviluppo e della maturazione dei linfociti mediante citometria.

Valutazione della fagocitosi mediante citometria.

Esempi di applicazioni non biomediche.

Cenni di sorting cellulare mediante citometria.

Esercitazioni teorico-pratiche.